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kurze Einführung

Die Ökotoxikologie, die sich als multidisziplinäre Wissenschaft seit ca. 1980 aus der Umweltchemie und Toxikologie heraus entwickelt hat, untersucht die Auswirkungen von Chemikalien auf die belebte Natur.
Zur Erfassung und Bewertung dieser Auswirkungen wurden zahlreiche biologische Testverfahren entwickelt.
Die von der IDUS – GmbH angebotenen Ökotoxizitätstests dienen sowohl der Untersuchung von Abwasser, als auch der Testung von einzelnen wasserlöslichen Substanzen oder Chemikalien.
Bei den Prüfrichtlinien handelt es sich um genormte Verfahren verschiedener Institutionen.

Die Untersuchung von Abwasser hinsichtlich ihrer ökotoxikologischen Verträglichkeit erfolgt in Deutschland nach DIN-Normen.
Das Grundprinzip der toxikologischen Abwasseranalytik erfolgt dabei in der Regel durch Ansetzen verschiedener Verdünnungsstufen (G –Werte) aus Abwasser und Verdünnungswasser, denen die Wasserorganismen ausgesetzt werden. Als Ergebnis wird die Verdünnungsstufe mit der höchsten Konzentration angegeben, in welcher die Organismen überlebt haben und keine in der Vorschrift beschriebenen Schädigungen aufweisen bzw. in welcher die Hemmeffekte (i.d.R. auf die Vermehrungsrate bei Algen und Bakterien) einen gewissen Grenzwert nicht unterschreitet. Bei der Angabe der Ergebnisse (z.B. GA=16) kennzeichnet der zweite Buchstabe den Testorganismus, während die Zahl die erste nicht toxische Verdünnungsstufe (hier Verdünnung 1:16) angibt.

Wasserlösliche Stoffe und Chemikalien werden oft durch europaweit genormte Tests nach OECD-Richtlinien auf ihre Toxizität gegenüber aquatischen Organismen geprüft. Auch hier werden die Testorganismen abgestuften Konzentrationen des Testguts ausgesetzt. Nach Ablauf der vorgeschriebenen Expositionszeit wird aus den Testergebnissen mittels statistischer Verfahren die Konzentration ermittelt, die einer 50-prozentigen Schädigung (Ec50 / Lc50) der Testorganismen entspricht. Hierdurch sind genauere Aussagen zur toxischen Wirkung möglich. Das "E" bei "Ec" steht dabei für "Effekt", wenn eine direkte Mortalität der Organismen ("L") nicht ermittelt werden kann (insbes. bei Algen und Bakterien).

Erläuterungen zu einigen wichtigen Ökotoxizitätstests:

• Pseudomonas-Zellvermehrungs-Hemmtest, mit P. putida, Ec10, Ec50
  (DIN 38412-8, EN ISO 10712-L8)

Testorganismus Alge

Grünalgen stellen als Primärproduzenten einen wesentlichen Bestandteil aquatischer Ökosysteme dar. Sie stehen am Beginn aquatischer Nahrungsketten und tragen zur biogenen Belüftung der Gewässer bei.
Die sich daraus ergebende hohe Bedeutung der Algen für den aquatischen Lebensraum macht sie zu einer wichtigen Testgrundlage für Biotests. Stellvertretend für Primärproduzenten werden leicht zu züchtende und sich schnell vermehrende Grünalgen verwendet.

In den Grünalgentests wird die Testalge (in der Regel Scenedesmus subspicatus) unter festgelegten Bedingungen in einem definiertem Nährmedium abgestuften Konzentrationen des Testguts ausgesetzt. Da bestimmte Stoffe in Abhängigkeit von ihrer Konzentration das Zellwachstum der Algen hemmen, wird diese Größe als Toxizitätsparameter verwendet. Die Hemmwirkung ergibt sich aus dem Vergleich der Zellvermehrung der Testalgen mit und ohne Einwirkung des Testguts.
Nach Ablauf des Tests (72h) wird die Anzahl der Zellen durch Zählung, Trübungs- oder Autofluoreszenzmessung bestimmt.

Bestimmung der nicht giftigen Wirkung von Abwasser gegenüber Grünalgen über Verdünnungsstufen
(DIN 38412-L33)

• geeignet zur Untersuchung von Abwasser
• Ergebnis ist die niedrigste Verdünnungsstufe, in der die Hemmung < 20% beträgt (GA-Wert)
• erforderliche Probemenge: 250ml

Wachstumshemmtest mit den Süßwasseralgen Scenedesmus subspicatus und Selenastrum capricornutum
(DIN EN 28692-L9 )

• geeignet zur Untersuchung von Wasser, Abwasser und wasserlöslichen Stoffen
• Ermittelt werden die Konzentrationen des Testguts bei denen keine Hemmung zu beobachten ist (no observed effect concentration, NOEC, entspricht den G-Werten in der Abwasseruntersuchung) und einer 50%igen Hemmung (Ec50) des Algenwachstums.
• erforderliche Probemenge: : 1 Liter bzw. wenige Gramm

Algen, Wachstumshemmtest (OECD 201)

• geeignet zur Untersuchung von Wasser, Abwasser und wasserlöslichen Stoffen
• als Bewertungsmaße gelten diejenigen Konzentrationen an Testgut mit einer 10 prozentigen (EC10) und 50 prozentigen (EC50) Hemmung des Algenwachstums
• erforderliche Probemenge: : 1 Liter bzw. wenige Gramm

Testorganismus Wasserlinse (Lemna minor)

Wasserlinsen stehen in der Reihe verfügbarer Testorganismen stellvertretend für höhere Pflanzen. Sie sind aufgrund ihrer geringen Größe gut als Testorganismus geeignet und können dauerhaft im Medium Wasser existieren. Der entscheidende Parameter für die Bewertung eines toxischen Effekts ist das Wachstum bzw. die Zunahme der Biomasse. Ausgewertet wird die Anzahl der Triebspitzen (Fronds) sowie die Trockenmasse bzw. hierfür ersatzweise auch die bewachsene Fläche, da dieser Parameter mit Hilfe von Bildauswertesystemen relativ schnell ermittelt werden kann.

Wasserlinsen, Wachstumshemmtest (DIN EN ISO 20079)

• geeignet zur Untersuchung von Wasser, Abwasser und wasserlöslichen Stoffen
• als Bewertungsmaße gelten diejenigen Konzentrationen an Testgut mit einer 10 prozentigen (EC10) und 50 prozentigen (EC50) Hemmung des Wachstums
• erforderliche Probemenge: : 1 Liter bzw. wenige Gramm

Testorganismus Kleinkrebs (Daphnia magna)

Daphnien sind ein wichtiger Bestandteil des Zooplanktons in stehenden Gewässern. Sie gehören als Vertreter aquatischer Wirbellose zur Klasse der Krebstiere (Crustacea) und innerhalb dieser zur Gruppe der Blattfußkrebse (Cladoceren). Diese Kleinkrebse ernähren sich aktiv schwimmend von einzelligen Mikroorganismen und sind somit als Konsumenten von Bakterien und Algen einerseits und als Nährtiere für Fische andererseits im Stoffstrom von Gewässern von Bedeutung. Als Testorganismus hat sich die Art Daphnia magna STRAUS wegen ihrer Größe, leichten Kultivierung und kurzen Generationszeit bewährt. Giftwirkungen auf diese Modellorganismen geben wichtige Rückschlüsse auf die Wirkung von Stoffen auf planktische Konsumenten.

In den Tests werden eine vorgegebene Anzahl an Daphnien abgestuften Konzentrationen des Testguts ausgesetzt. Als Mortalitätskriterium gilt der Verlust der Schwimmfähigkeit der Kleinkrebse.

Bestimmung der nicht akut giftigen Wirkung von Abwasser gegenüber Daphnien über Verdünnungsstufen
(DIN 38412-L30)

• Verfahren geeignet zur Untersuchung von Abwasser
• ermittelt wird die Verdünnungsstufe, die nach 24h keine akut giftige Wirkung auf die Testoranismen aufweist
• erforderliche Probemenge: 250ml

Daphnia magna Reproduktionstest (OECD 211)

• chronischer Toxizitätstest über 21 Tage
• geeignet zur Untersuchung von chemischen Substanzen, die unter den Testbedingungen löslich sind, oder als stabile Suspension oder Dispersion erhalten bleiben
• Test kann in zwei Stufen durchgeführt werden (Vortest nach OECD 202 Teil 1 -akuter Immobilisationstest; endgültiger Test nach OECD 211)
• als Parameter für die Toxizität der Probe gilt die Verringerung des Reproduktionserfolges
• ermittelt werden die Werte für NOEC (no observed effect concentration), LOEC (lowest observed effect conc.) und Ec50
• erforderliche Probemenge: 10 bis 20 Liter bzw. wenige Gramm

Bestimmung der Hemmung der Beweglichkeit von Daphnia magna STRAUS (DIN EN ISO 6341 - L40)

• geeignet zur Untersuchung von chemischen Substanzen, die unter den Testbedingungen löslich sind, oder als stabile Suspension oder Dispersion erhalten bleiben, Abwässern, Oberflächen -oder Grundwasser
• ermittelt wird die Konzentration die wahlweise nach 24h oder 48h zu einer Bewegungshemmung von 50% der eingesetzten Daphnien führt (EC50)
• erforderliche Probemenge: 1 Liter bzw. wenige Gramm

Akuter Immobilisierungstest (OECD 202)

• geeignet zur Untersuchung von chemischen Substanzen, die unter den Testbedingungen löslich sind, oder als stabile Suspension oder Dispersion erhalten bleiben, Abwässern, Oberflächen -oder Grundwasser
• ermittelt werden die Werte für Lc50, Lc0 (höchste geprüfte Konzentration, bei der sämtliche Daphnien den Test überleben) und Lc100 (niedrigste geprüfte Konzentration, bei der alle Testorganismen während des Tests sterben) nach 24h oder 48h
• erforderliche Probemenge: 1 Liter bzw. wenige Gramm

Testorganismus Fisch

Tests mit Fischen sind für die Bewertung der ökotoxikologischen Wirkungen von Chemikalien wichtig, da sie als Wirbeltiere zu den hochentwickelten Organismen aquatischer Ökosysteme gehören. Bei Veränderungen der Wasserqualität entstehen Schädigungen, die unter Umständen bis zum Tod des Tieres führen. Solche Schäden können zum Beispiel das Verkleben und Verschleimen der Kiemenblättchen oder die Aufnahme von Schadstoffen über die Kiemen, die Haut oder den Verdauungstrakt sein. Nur wenige Arten werden stellvertretend für etwa 20000 existierenden Fischarten aufgrund der geforderten Praktikabilität in der Toxizitätsprüfung verwendet. Die am häufigsten zu Testzwecken verwendeten Arten sind der Zebrabärbling (Danio rerio), die Goldorfe (Leuciscus idus), die Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) oder der Japanische Reiskärpfling (Oryzias latipes).
Zur Abwasserüberwachung ist in Deutschland der Fischtest nicht mehr zugelassen. Als Alternative wurde der Fischeitest entwickelt und in der Praxis etabliert.

Fische, akuter Toxizitätstest (Danio rerio, Leuciscus idus o.a.) (OECD Guideline 203)

• Verfahren geeignet zur Untersuchung von wasserlöslichen Substanzen und Substanzgemischen
• ermittelt werden nach 96h die Werte für Lc50, Lc0 (höchste geprüfte Konzentration, bei der sämtliche Fische den Test überleben) und Lc100 (niedrigste geprüfte Konzentration, bei der alle Fische während des Tests sterben)
• erforderliche Probemenge: je nach Giftigkeit wenige Gramm
  

Bestimmung der nicht akut giftigen Wirkung von Abwasser auf die Entwicklung von Fischeiern über Verdünnungsstufen (DIN 38415-T6)

• Verfahren geeignet zur Untersuchung von behandeltem Abwasser
• zur Bestimmung werden die befruchteten Eier des Zebrafisches (Danio rerio) verwendet
• ermittelt wird die Verdünnungsstufe ohne sichtbaren Einfluss auf die Entwicklung der Fischeier (GEi-Wert)
• als Mortalitätskriterium gelten Tod und definierte Störungen der Embryonalentwicklung
• Testdauer: 48h
• erforderliche Probemenge: 250ml

>mehr zum Fischeitest

Bakterien als Testorganismus

Bakterien spielen als Destruenten eine bedeutende Rolle beim Ab- und Umbau von organischen Stoffen zu Nährstoffen. Sie sind als Testgrundlage geeignet, da sie wegen ihrer kurzen Generationszeit und hohen Stoffwechselaktivität schnell durchführbare und kostengünstige Tests erlauben. Andererseits werden Toxizitätstests auf zellulärer Ebene eine geringe ökologische Relevanz zugesprochen.
Einer der gebräuchlichsten Toxizitätstests ist der Leuchtbakterientest. Als Testorganismen kommen Leuchtbakterien (Vibrio fischeri) gefriergetrocknet, frisch gezüchtet oder flüssig getrocknet zur Anwendung. Es handelt sich hierbei um ein fakultativ anaerobes, gram-negatives Stäbchen, welches als marines Bakterium halophil (salzliebend) ist. Leuchtbakterien senden als Produkt ihres Stoffwechsels ein kaltes Leuchten (Bioluminiszenz) aus. Eine gleichmäßige Luminiszenz deutet auf einen ungestörten Stoffwechsel hin. Schadstoffe können diese Lichtemission in definierter Weise hemmen.

Bestimmung der Hemmwirkung von Wasserproben auf die Lichtemission von Vibrio fischeri (Leuchtbakterientest) (DIN EN ISO 11348-3 L34)

• Verfahren gilt für Abwasser, wässrige Extrakte und Sickerwasser, Süßwasser,
  salzhaltige Wässer und Porenwasser
• Toxizitätsparameter ist die Hemmung der Lichtemission der Bakteriensuspension, die Leuchtintensitätsabnahme wird gegenüber einem Kontrollansatz gemessen
• ermittelt wird mit Hilfe einer Verdünnungsreihe aus Testgut, Verdünnungswasser und Leuchtbakteriensuspension die Verdünnungsstufe, die einen Lichtverlust von < 20% bewirkt (GL - Wert)
• erforderliche Probemenge: 100ml
  

Der Fischeitest

Der Fischeitest ist ein ökotoxikologischer Test, bei dem die befruchteten Eier des Zebrabärblings (Danio rerio) als Testgrundlage verwendet werden. Zebrabärblinge stammen ursprünglich aus stehenden und fließenden Gewässern Südasiens und produzieren ganzjährig nichtklebende, transparente Eier. Innerhalb der Klasse der Knochenfische (Osteichthyes) gehört er zur Familie der Karpfenfische (Cyprinidae).
Als Mortalitätskriterium gelten der Tod der Embryonen und definierte Störungen der Embryonalentwicklung, die früher oder später zum Tod führen würden, wie fehlender Herzschlag, fehlende Körpersegmente (Somiten) oder eine generell stark verlangsamte Entwicklung.

Der Test wird in Multiwell-Platten durchgeführt, wobei jede Kammer mit einem befruchteten Ei bestückt wird. Nach 48 Stunden erfolgt die mikroskopische Auswertung, wobei neben der Koagulation der Eier, was mit dem Absterben des Embryos verbunden ist, auch die anderen oben genannten Merkmale registriert und bewertet werden.

Der Fischeitest ist ein Beispiel für die ständige Weiterentwicklung und Optimierung der ökotoxikologischen Untersuchungsmethoden. Deutlich wird dies an der am 01.01.2005 in Kraft getretenen Änderung des sächsischen Abwasserabgabengesetztes, in welcher der Fischtest zur Ermittlung der Giftigkeit von Abwässern vom Fischeitest ersetzt wurde. Hauptgrund für diese Gesetzesänderung ist, dass der Fischeitest im Gegensatz zum Fischtest nicht als Tierversuch, sondern als "suborganismischer" Test gilt, da das Zentralnervensystem der Fischembryonen zur Versuchszeit noch nicht voll entwickelt ist.
Die in der Richtlinie vorgegebene Expositionszeit der Eier im Testmedium erstreckt sich über das Embryonalstadium (von der Befruchtung bis zum Schlupf) der Zebrafische. Während dieser Zeit laufen sensible Wachstums- und Entwicklungsprozesse ab, die sehr empfindlich auf Schadstoffe im umgebenden Wasser reagieren. Veränderungen der Wasserqualität wirken sich deshalb auf die frühen Lebensstadien von Fischen meist drastischer als auf adulte oder selbst Jungfische aus.
Ein Vorteil des Fischeitestes ist es weiterhin, dass neben akuten Mortalitätskriterien auch teratogene (fruchtschädigende) Wirkungen einer Testsubstanz beobachtet werden können, wie z.B., nachfolgende Abbildung belegt, bei der infolge der Substanzeinwirkung eine starke Wirbelsäulenverkrümmung zu beobachten war.